http://www.fssos.com/ 2004-9-3 16:40:28 中华风湿病学杂志
基因重组干扰素-γ对类风湿关节炎患者体内免疫调节
曹之舫等（第二军医大学医学生物技术和分子遗传研究所，上海200433）
孟济明等（第二军医大学附属长海医院内科风湿病专业组，上海200433）
摘要 用重组基因干扰素γ（γIFN-γ）1.0*106U治疗类风湿关节炎（RA）患者并检测多项免疫学指标，结果表明，患者的总T淋巴细胞、T4/T8比值无明显改变，淋巴细胞表达Tac抗原和MHCⅡ类抗原的水平亦与治疗前相似；但淋巴细胞转化率由治疗前的异常升高降至正常范围，单核细胞HLA-DR表达由68%提高至79%，HLA-DP、-DQ的表达则增加了一倍以上。研究结果显示γIFN-γ对RA有较强的体内免疫调节作用。
关键词 γIFN-γ RA T细胞亚群 单核细胞 MHCⅡ类抗原
体外刺激试验表明干扰素γ能促使MФ的肿瘤细胞杀伤效应，增强NK细胞的细胞毒活性以及诱导人外周血单核细胞、腹水中的卵巢癌细胞和骨髓瘤细胞系表达MHCⅡ类抗原，但欲确切的了解IFN-γ对人体免疫系统的调节作用，还有赖于替内实验结果。文献报道用IFN-γ治疗恶性肿瘤和AIDS后患者一些免疫学指标的变化不尽一致。本文报告用人基因重组干扰素γ（γIFN-γ）治疗类风湿性关节炎（RA）前后的T细胞亚群、MHCⅡ类抗原的诱导表达以及淋巴细胞转化率等指标的变化
材料与方法
1.1 试剂
T细胞亚群、Tac抗原（IL-2受体）以及HLA-DR和-DQ单抗与FITC标记的二抗均购自卫生部武汉生物制品研究所；淋巴细胞分离液，上海试剂二厂；PHA，广州医药公司；RPMI1640，日本日水制药株氏会社出品；实验中所用其他化学试剂均为分析纯。
1.2 rIFN-γ
本所研制，纯度大于95%，比活性2.0*107U/mg，每瓶含量为1.0*106U，溶于1ml注射用水后使用。
1.3 病例及治疗方案
RA患者24例，男性9例，女性15例，符合ARA（1987）诊断标准，病期Ⅰ—Ⅱ期，患者如院前未用或停用其他抗风湿药物，如院后给予rIFN-γ1，0*106U肌肉注射，每周连续用药5d，停2d，共用4w，分子用药前和用药后7d、28d采血测定淋巴细胞转化率、T细胞亚群分类、Tac抗原表达以及淋巴细胞和单核细胞HLA-DR、-DP和-DQ的表达水平。
1.4 细胞准备
静脉采血，肝素（125U/ml）抗凝，加等量Hanks液，混合后用淋巴细胞分离出单个核细胞，用含2%FCS的Hanks液（下同）洗2次后重悬于RPMI1640完全培养基中，将细胞悬液加于直径3cm塑料平皿中（美国CORNING公司产品，预先加3mlFCS,370C2h）,370C温育45min，小心吸取含有未粘附细胞的上清，并用培养基轻轻冲平皿2次，将冲洗液与上清混合，离心、洗细胞2次，此为淋巴细胞悬液；平皿中的黏附细胞用1.0mmol/L EDTA消化3-5min，收集细胞液，Hanks液洗2次后重悬于完全培养基中，此为单核细胞液。台盼蓝拒染试验显示活细胞占98%，形态学观察和非特异性酯酶染色证实92%为单核细胞。调整淋巴细胞和单核细胞浓度至2.0*106/ml。
1.5 T细胞亚群分类和Tac抗原表达
淋巴细胞悬液50 1中分别加入WuT3、WuT4、WuT8单抗或Tac单抗50 ，40C水浴30min，洗3次后取样滴于玻片上，加盖玻片于显微镜下观察荧光阳性的细胞并用普通透射光计数淋巴细胞总数。
1.6 淋巴细胞和单核细胞MHCⅡ类抗原的表达
除一抗改用HLA-DR、-DP或-DQ单抗外，其余操作步骤同1.5，为防止单核细胞粘附于管壁，在30min分钟反应期间将试管置于脱色摇床（上海申化生化公司）上，边摇动边反应，效果较好。
1.7 淋巴细胞转化实验
按文献[9]方法进行。
讨 论
淋巴细胞转化是反映T淋巴细胞功能的一项重要指标，RA患者的淋转率高于正常人，提示前者的淋巴细胞受免疫源的刺激处在一种较高的应激状态，用rIFN-γ治疗后第7d和第28d的淋转率较治疗前明显下降，表明rIFN-γ对体内过高的免疫应激状态具有某种副调节作用。rIFN-γ能诱导T细胞表达IL-2受体。可能是与IL-2联合应用以提高抗肿瘤效应的机理之一，但本文结果未显示用rIFN-γ治疗RA后能提高IL-2受体阳性淋巴细胞的百分率。有人报道，给患者使用rIFN-γ后T细胞总数及亚群没有变化。Faltynek等用rIFN-γ处理U937细胞24h，致该细胞系对CD4的表达下降了50%，新分离的外周血单核细胞经IFN- 处理后亦出现相似的结果，认为CD4分子表达降低与细胞表面CD4分子丧失有关，但Thompaon等却发现，给癌症患者使用IFN- 后24h，T4/T8比值可由2.1上升至4.1，比值升高的原因是T4数量增加而T8数量减少，24h后比值可降至基线水平。上述结果的不一致除了实验途径不同外，可能与病种不同，患者的个体差异以及用药计量等有一定关系。本文结果表明，RA患者用药后第7d和第28d的T细胞总数及亚群分类与用药前无明显差异。IFN- 能增强单核细胞MHCⅡ类抗原的表达已有报道，Conwa等的实验结果显示人所有的单核细胞经IFN- 体外刺激后均有表达MHCⅡ类抗原分子的能力。对RA患者外属血中新分离出的单核细胞的检测结果证实，rIFN-γ能在体内诱导单核细胞表达MHCⅡ类抗原，HLA-DP和-DQ阳性细胞在用药后增加了一倍以上，基础表达水平较高的HLA-DR亦由治疗前的68%提高至80%左右，单治疗前后淋巴细胞表达MHCⅡ类抗原的水平相近。单核细胞是机体免疫反应中重要的抗原提呈细胞，MHCⅡ类抗原表达增强将大大提高单核细胞的抗原提呈能力，但这一点在RA的治疗中有何实际意义尚需做进一步探讨。根据我们的实验结果及文献报道，有两点似应注意：（1）IFN-γ具有双向免疫调节作用，这种双向调节与IFA-γ用量有关，在一定剂量范围内为正向调节，高剂量IFN-γ由于其抗增殖效应大于激活效应，可表现为负向调节；（2）部分免疫调节效应需在IFN-γ治疗持续一段时间后才能显示出来。
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