中华儿科杂志 2000年第8期第38卷 论著

幼年类风湿性关节炎与人细小病毒B19感染的关系及其临床特征

作者：成胜权　张国成　许东亮

单位：成胜权（710032　西安，第四军医大学西京医院儿科）；张国成（710032　西安，第四军医大学西京医院儿科）；许东亮（710032　西安，第四军医大学西京医院儿科）

关键词：细小病毒B19，人；关节炎，幼年型类风湿；聚合酶链反应

Relationship between human parvovirus B19 infection and juvenile rheumatoid arthritis and its clinical forms

CHENG Shengquan，ZHANG Guocheng，XU Dongliang
（Department of Pediatrics，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032, China）

　　【Abstract】　Objective　It was reported since 1985 that human parvovirus B19 (HPV B19) was associated with human joint disorders. However we have not seen such reports in Chinese journals. The present study aimed at investigating possible relationship between HPV B19 infection and juvenile rheumatoid arthritis （JRA） and its different clinical types in children. Methods　The DNA of HPV B19 was determined by using nested PCR in serum specimens of 30 children with JRA (group 1)，15 healthy blood donors and 10 normal children (control group),in bone marrow specimens of 26 children with JRA (group 2)，and in joint fluid specimens of 4 children with JRA (group 3). Results　（1）Of the 30 cases with JRA in group 1，12 （40%） were positive for HPV B19 DNA,in contrast,only one (4%) of the control specimens was positive for the DNA (P<0.01). （2）Bone marrow specimens of 12 （46 %）of the 26 cases of group 2 were positive for HPV B19 DNA, while only one of the 10 (1/10) was positive(P>0.05). （3）Of 8 cases whose serum and bone marrow specimens were tested,2 (2/8）had HPV DNA in both serum and bone marrow，while another 2 had the DNA only in bone marrow and one only in serum. （4）Tow out of the 4 JRA cases in group 3 had HPV B19 DNA in both serum and joint fluid specimens,one had the DNA only in the joint fluid.（5）Serum specimens of totally 12 children with JRA were positive for HPV B19 DNA; the clinical form of arthritis was systemic in 4,polyarticular in 4 and oligoarticular in the remaining 4; HPV B19 DNA positive rates for the corresponding clinical forms of JRA were 4/9, 4/11 and 4/10, respectively. Among the 12 children with JRA who had HPV B19 DNA in the bone marrow specimens, the positive rates of the DNA for the above mentioned clinical types were 56% （9/16）， 2/5 and 1/5, respectively. Conclusion　JRA children in the studied series had a higher rate of HPV B19 infection as compared to the control group. The JRA cases exhibited a close association with HPV B19 infection. HPV B19 -infected JRA cases mostly had systemic or polyarticular types of the disease.
　　【Key words】　Parvovirus B19，human;　Arthritis, juvenile rheumatoid;　Polymerase chain reaction

资料和方法

　　一、标本来源
　　来自1995年8月～1999年3月我院儿科、西安市儿童医院因JRA 住院和门诊患儿的血清(BS)标本共30例，其中男23，女7，年龄2～14岁；另有26例JRA患儿骨髓（BM）标本来源于1992年2月～1999年3月，由我院血液室提供；4例关节液（SF） 标本通过穿刺或关节镜留取，来自1998年6月～1999年3月。对照组BS标本25例（健康献血员15例，本院工作人员子女10例），均自静脉采血，分离血清-20℃冰箱保存备用待检。10例对照组BM标本为缺铁性和巨幼细胞性贫血患儿。
　　诊断标准及分型：根椐中华儿科杂志1996年第34期第4卷关于JRA的诊断及分型建议；活动期标准：临床症状+体征+血沉增快。
　　本组除2例为门诊病例外，其余均为住院患儿,且处于活动期，其中BS组30例中JRA全身型9例，多关节型11例，少关节型10例。BM组26例中JRA全身型16例，多关节型5例，少关节型5例。
　　二、方法
　　1．主要试剂及引物：10×PCR 缓冲液和Taq DNA聚合酶（复华公司），4×dNTP(脱氧三磷酸核苷)和琼脂糖（美国Perkin Elmer Cetus公司），蛋白酶K（美国Merck公司）。PGEM Markor (华美公司)。引物由上海生工生物工程公司合成，外引物：1S对应于B19-DNA碱基位置为2905-2924；2A对应于4016-3997，循环产物1112 bp，引物碱基顺序为1S 5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′；2A 5′-ACACTGAG-TTTACTAGTGGC-3′。内引物： 3S对应于B19-DNA碱基位置为3187-3206，4A对应于3290-3271，扩增产物104 bp，引物碱基顺序为3S 5′-CAAAAGCATGT-GGAGTGAGG-3′，4A 5′-CCTTATAATGGTGCTCTGGG-3′。病毒来源：B19阳性对照模板由沙特皇家医院研究中心提供，经提纯后含量为70 μg/L。
　　2．BS标本DNA提取：方法按参考文献［1］介绍的方法进行。待检标本-20℃冰箱取出解冻，取50 μl加入裂解液100 μl中 (10×50 mmol氯化钾，10×0.45% NP-40，10×0.45%吐温-20，10×10 mmol 三羟甲基氨基甲烷*盐酸，pH值8.3，10×2.5 mmol 氯化镁，10×0.1 mg/ml明胶等各10 μl，蛋白酶K 20 μg，均经高压灭菌），振荡混匀，水浴箱依次65℃ 1 h充分消化，95℃ 10 min灭活蛋白酶K，离心（15 000 r/min）15 min，取上清-20℃冰箱保存。
　　3.BM标本DNA提取：按参考文献［2］方法进行。取经瑞氏染色室温存档或新鲜骨髓片2～3张，用高压灭菌新手术刀片刮取血膜置Eppendorf反应管中，加入300 μl裂解液。55℃温育5 min，55℃消化1～2 h。加入300 μl苯酚抽提1次，将水相移入另一Eppendorf反应管中，加入30 μl浓度为3 mmol/L的乙酸钠（pH值5.6）及750 μl无水乙醇，-20℃放置2 h。15 000 r/min离心10 min，弃上清。用70%冷乙醇（4℃）洗涤1次，风干后加入双蒸水20～30 μl溶解DNA备用。可供3～4次PCR扩增所需之模版。
　　4．SF标本DNA提取：同BS标本DNA提取。
　　5.巢式PCR扩增B19-DNA第1次PCR循环：50 μl反应体系中，双蒸水33 μl，10×PCR 缓冲液 5 μl，4×dNTP 4 μl，Taq酶1 μl，外引物1S和2A各1 μl（300 ng），模板5 μl（阳性对照1 μl，阴性对照为双蒸水）。充分混匀，离心振荡后30 μl石蜡油覆盖进行PCR循环，循环条件：93℃ 1 min，55℃ 1 min 30 s，72℃ 1 min，35周期后，72℃充分延伸10 min。第2次循环：取第1次循环产物5 μl为模板，以内引物3 S、4 A代替外引物，同上述反应体系及条件。
　　6．结果观察：取第2次循环产物10 μl与3 μl溴酚蓝混合，取10 μl加样于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳30～40 min（电压50 V），紫外分析仪上观察，104 bp处出现特异电泳带者为阳性。

结　　果

　　一、BS标本B19-DNA的巢式PCR检测结果
　　30例JRA患儿和25例正常对照组B19-DNA检出率比较，前者阳性12例，阳性率40%；后者阳性1例（健康献血员），阳性率4%，差异有非常显著性（P<0.01）。
　　二、12例BS标本B19-DNA阳性 JRA不同临床分型的比较
　　3组阳性率差异均无显著性（P>0.05）（表1）。
　　三、26例BM标本B19-DNA的巢式PCR检测结果
　　26例JRA B19-DNA阳性12例，阳性率为46%，10例对照组中1例阳性，阳性率10%，两组差异无显著性（P>0.05）。
　　四、12例BM标本阳性患儿临床分型情况比较

表1　JRA分型与BS标本B19-DNA阳性比较

　　3组阳性率差异无显著性（P>0.05 ）（表2）。

表2　JRA分型与 BM标本B19-DNA阳性比较

　　五、8例BS、BM配对标本B19-DNA的检测结果
　　BS、BM标本同时阳性2例（2/8），只BM标本阳性2例（2/8），只BS标本阳性1例（1/8）； BM标本总阳性率为4/8， BS标本总阳性率为3/8。
　　六、4例BS、SF配对标本B19-DNA的检测结果
　　BS、SF标本B19-DNA同时阳性2例（2/4），只SF标本阳性1例（1/4）； SF标本总阳性率为3/4。

讨论

　　JRA是小儿时期一种常见的全身性结缔组织病，临床除全身表现外，主要以慢性非化脓性滑膜炎长期导致滑膜增生，软骨及软骨下骨组织破坏，部分患儿导致永久性关节畸形的难治性疾病，对儿童危害极大。其病因和发病机制至今尚不十分清楚。近年的研究发现许多病原微生物与JRA的发生有关，主要有B19、风疹病毒、EB病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、支原体等。1985年White和Reid等首次报道B19病毒与人类关节病相关，但此方面研究大多集中在急性关节炎或RA，有关JRA与B19病毒的相关性，只有少量报道，而且为国外资料。1994年Kerr等^［3］调查1984年至1989年85例北爱尔兰人B19感染患者（年龄4～63岁），发现68例（80%）表现有关节炎或关节痛。1995年Kerr等^［4］报道急性B19感染儿童患者53例（年龄2～7.5岁）中，16例（30%）表现为关节炎。1993年Nocton等^［5］检测104例儿童关节炎患者，发现22例（21%）与B19感染有关。Saal等^［6］采用PCR方法检测了20例RA患者的血及关节滑膜组织B19-DNA，结果阳性15例（75%），提示B19感染与RA高度相关。Mimori等^［7］对108例RA和JRA研究发现，难治型RA和多关节炎型JRA B19感染率分别为57.6%和71.4%，与对照组相差非常显著。本研究结果显示，JRA 与B19病毒感染有密切的相关关系，B19病毒可能是我国JRA患儿主要的病毒病因之一。
　　B19致关节炎的机理目前尚不清楚^［8］。1997年Cassinoptti等^［9，10］研究认为B19引起慢性关节炎与机体免疫力低下有关，认为人关节滑膜细胞上有B19特定结合位点，一旦患者有其他病毒（如腺病毒或疱疹病毒）感染，引起结合点活化就可发病，故有关B19致关节炎的发病机制尚有待进一步研究。

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